实验项目相关信息
1.实验方法与步骤要求
1．小鼠的处理：
免疫是单抗制备过程中的重要环节之一，其目的在于使B淋巴细胞在特异抗原刺激下分化、增殖，以利于细胞融合形成杂交细胞，并增加获得分泌特异性抗体的杂交瘤的机会。提前一周，取BALB/C小鼠进行免疫，用抗原物质加入不完全弗氏佐剂混合，腹腔注射，免疫小鼠。
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图3. 免疫小鼠
2．小鼠滋养细胞（巨噬细胞）获取：
小鼠滋养细胞（巨噬细胞）获取：将小鼠带入超净工作台，腹面朝上进行解剖，充分暴露腹部。用镊子提起腹膜，剪开一个小口，向腹腔内注射入适量培养液，小心反复冲洗腹腔，吸出培养液至离心管中，反复冲洗2-3次，再离心洗涤1-2次（1000rpm，5min）。重悬细胞，进行细胞计数。配制HAT培养液，并重悬细胞，调整巨噬细胞浓度为2X105个/mL。取巨噬细胞悬液滴入96孔板，每孔0.1mL，二氧化碳培养箱培养。
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图4. 小鼠滋养层细胞获取
3．脾脏B细胞获取：
取经过免疫的BALB/C小鼠，带入超净工作台，无菌解剖操作，取出脾脏，并将脾脏置入无菌PBS缓冲液中进行冲洗。再次将小鼠脾脏移入另一无菌培养皿中，用无菌注射器在小鼠脾脏多处戳出小孔，用总体积5mL左右的 PBS缓冲液将脾脏B细胞从脾脏中冲出，吸取B细胞悬液并转移至离心管中，离心（1000rpm，5min），收集细胞，弃上清，加入1640培养液，重悬细胞，重复离心（1000rpm，5min），洗细胞。洗涤细胞后，重悬细胞，利用血球计数板对脾细胞进行计数。取出适量骨髓瘤细胞置于离心管中，同样利用血球计数板进行细胞计数。
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图5. 脾脏B细胞获取
4．细胞融合（1）
1）将计数后的B细胞和骨髓瘤细胞以10:1的比例混合，离心（1500rpm，5min），弃上清，取沉淀，取无血清1640培养液重悬细胞，洗细胞1-2次，得糊状细胞。将该细胞混合物转入37度水浴，吸取1mL PEG加入离心管中，边加入边混匀，1min之内加入全部PEG，并继续振荡1-1.5min。
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图6. 细胞融合（1）
5．细胞融合（2）
加入预热无血清1640培养液，2min后加入1mL培养基、再5min加入4mL，5min加入5mL，5min加入19mL，使培养基和PEG总量达到30mL，在加入培养基的过程中，不断旋转离心管，轻柔的混合细胞。
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图7. 细胞融合（2）
6．离心收集细胞
离心收集细胞（1000rpm，10min），吸出培养基，加入1mL不含有HAT的融合用培养基，.png)
图8. 离心收集细胞
轻轻吹散细胞成小球，弄散细胞团块，加入培养基使细胞悬浮于30mL的融合培养基中。
7．融合细胞培养
在两个50mL的离心管中，分别加入10mL上述细胞悬液，补加培养基至48mL（无HAT，3管总量144mL）。将之前制备滋养细胞的96孔板取出，吸取出培养液，在每孔中加入融合细胞，每孔加入0.1mL细胞悬液进行培养。
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图9. 融合细胞培养
8．融合细胞的先择性培养
培养48小时后，每孔加入新鲜的选择性培养基（含2 X HAT）0.1mL，由此获得1 X HAT选择性培养基。每间隔4-5天，更换新鲜的培养基，随时进行观察检测，约2-5周后可见细胞克隆群，取出上清，以备ELISA检测抗体的生成及含量。
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图10. 融合细胞的选择性培养
9．融合细胞的鉴定及筛选
将抗原以pH 9.6的NaCO3-NaHCO3进行包被，每块酶标板以5-20 ug抗原为宜。每孔的包被体积为50-100 uL。37 ℃包被2 h或4 ℃包被过夜。倒掉抗原，拍干酶标板孔内液体，以0.5-1% PBS（用PBST溶）或5% 脱脂牛奶（PBST溶解）或1% 明胶（PBST溶解）于37 ℃封闭2 h或4 ℃封闭过夜。封闭完后，弃去孔内液体，拍干，加入待检测胞上清，每孔100 uL为宜。在每块板子上做好记号。37 ℃孵育1 h。孵育完一后，弃去孔内液体，拍干，以PBST洗3次，每次5min。根据二抗说明稀释好二抗，每孔加100 uL.37 ℃孵育1 h。 孵育完二抗后，弃去孔内液体，拍干，加入显色剂。待颜深时用终止液终止反应。用酶标仪读出各孔OD值，选择出阳性孔。
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图11. 融合细胞的鉴定与筛选
10．抗体检测阳性孔细胞的扩大培养
对于抗体检测阳性孔的细胞须进行扩大培养，并冻存。获得的杂交瘤细胞进行细胞计数后，准确的进行系列稀释，直到每mL含有10个细胞，按照每孔接种0.1mL细胞悬液，使每孔含有1个细胞，以获得单克隆抗体细胞株，进行培养及冻存。
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图12. 抗体检测阳性孔细胞的扩大培养
11．单克隆抗体的大量制备-腹水的制备
提前一周，取BALB/C小鼠进行免疫，用抗原物质加入不完全弗氏佐剂混合，腹腔注射，免疫小鼠。在注射佐剂后一周，将生长旺盛的杂交瘤细胞离心，弃去培养基，用PBS或者不完全培养基重悬后注射到小鼠腹腔，一般7-10天后就可以看到小鼠腹腔明显肿大，此时处死小鼠，采集腹水，离心除去细胞的成份，同时也去掉油脂（油脂的密度比较小，一般都漂浮在腹水表面，用枪吸出丢掉即可）。
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图13. 单克隆抗体的大量制备—腹水的制备